流式細(xì)胞分析方案主要分為4個(gè)步驟：  

• 樣品制備：應(yīng)通過機(jī)械分離方法或化學(xué)解離技術(shù)制備單細(xì)胞懸液，如采用酶溶液或鈣螯合試劑。

• 封閉：通常采用抗Fc抗體稀釋液懸浮細(xì)胞，防止一抗非特異性結(jié)合。

• 抗體孵育：流式細(xì)胞分析的孵育步驟涉及多種組分，包括一抗、二抗、鏈霉親和素和熒光染料。

• 數(shù)據(jù)采集：大多數(shù)流式細(xì)胞儀都配備獲取和轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征信號(hào)必需的軟件。用戶可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)要求設(shè)定具體的軟件參數(shù)。

適當(dāng)?shù)膶?duì)照

除了目標(biāo)細(xì)胞之外，每次進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還應(yīng)包含以下對(duì)照：

• 至少一份未染色樣品，與試樣同時(shí)進(jìn)行每一步的緩沖液孵育，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的流速和電壓。

• 一份適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照樣品，與試樣基本相同，但用在一抗的宿主種屬中生產(chǎn)的同型對(duì)照替代試樣中的一抗。該對(duì)照用于非特異性結(jié)合二抗。

• 如有需要也可準(zhǔn)備一份已知表達(dá)所有目標(biāo)抗原的細(xì)胞組成的陽性對(duì)照，并與試樣共同孵育，但僅用單色檢測(cè)。

流式免疫檢測(cè)

同其他免疫檢測(cè)應(yīng)用一樣，流式細(xì)胞分析也可通過多種方法利用抗體探測(cè)特定的細(xì)胞基元。兩大常用方法為：直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法。

直接檢測(cè)法

直接檢測(cè)法是一種一步染色工藝，通過一抗特異性結(jié)合目標(biāo)抗原，可直接結(jié)合支持成像或其他結(jié)合狀態(tài)檢測(cè)的分子。探測(cè)位于細(xì)胞表面的抗原時(shí)，不建議固定細(xì)胞，否則可能導(dǎo)致抗體探針無法接觸目標(biāo)抗原。因此，在數(shù)據(jù)采集結(jié)束前保持細(xì)胞活力十分重要。如要查找直接檢測(cè)法的抗體，可采用Antibody Explorer抗體搜索工具，將Search Within（搜索范圍）設(shè)為“Primary Antibodies Only"（僅限一抗），application（應(yīng)用）選擇“flow cytometry"（流式細(xì)胞分析）。

間接檢測(cè)法

間接檢測(cè)法先用純化抗體與目標(biāo)抗原孵育結(jié)合，再用熒光染料標(biāo)記的二抗（特異性靶向一抗宿主同型）與一抗特異性結(jié)合，形成一抗-熒光二抗復(fù)合物。采用純化一抗搭配各種波長（或顏色）的熒光染料標(biāo)記二抗（特異性針對(duì)生產(chǎn)一抗的宿主同型）可提升抗體庫的模塊化程度。